葉によるビタミン要求性への代謝適応

ISME Journal volume 16、pages 2712–2724 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

栄養要求性生物は、代謝に必要な代謝産物をすべて合成することができず、他の代謝産物の提供に依存しています。 それらは、実験室で生成および進化した突然変異体で集中的に研究されてきたが、栄養要求性に対する新たな適応メカニズムは体系的に扱われていない。 今回、我々はシロイヌナズナの葉から単離した細菌の栄養要求性を調査し、最大半数の菌株がビオチン、ナイアシン、パントテン酸および/またはチアミンに対する栄養要求性を有することを発見した。 次に、栄養要求性の遺伝的基盤と、ビタミン栄養要求性と併発する形質を調査しました。 私たちは、栄養要求性株は一般に、ビタミンを補給しなくても1〜3倍に指数関数的に増殖する能力を備えた補酵素を貯蔵していることを発見しました。 ただし、観察された最も高い保存量はビオチンであり、1 株で 9 回の倍加が可能でした。 共培養実験では、栄養要求性株へのビタミン供給を実証し、外部からビタミンを補給すると、栄養要求性株が原栄養株よりも高い種の豊富さを維持することがわかりました。 消費者資源モデルの拡張により、栄養要求株が他の生物から提供される炭素化合物を利用できることが予測され、栄養要求株がビタミンを超えた代謝副産物から恩恵を受けていることが示唆されました。

補酵素は細胞の代謝に不可欠です。 これらは多くの酵素触媒反応 (酸化還元反応、アミノ基転移、炭素-炭素結合形成など) の中心を形成し、1 炭素単位や有機酸のキャリアとして機能します [1]。 生合成に欠陥のある栄養要求性生物は、補酵素または補酵素前駆体分子、つまりビタミンを外部から供給しなければなりません。 彼らは成長を可能にするために環境中のビタミンの供給に依存しているため、補酵素が不安定になると外部からの供給の必要性がさらに高まります。 最近、補酵素の炭素主鎖が生体内で安定であることが示されました [2]。 実際、補酵素の寿命、つまり細胞内での分解と再構築がないことは、進化的に選択された可能性のある固有の特性であり [2, 3]、栄養要求性生物の増殖の前提条件と考えることができます。 栄養要求性の要件は、大腸菌集団で示されているように、栄養豊富な培地での実験室の進化実験で急速に進化する可能性があります [4]。 栄養要求性株も自然界から単離されており、多くの場合遺伝子喪失の結果です [5、6、7]。 しかし、ほとんどの環境において細菌に栄養要求性がどの程度一般的に存在するかは現時点では不明です。 最近の多くの研究では、ゲノムスケールの代謝モデルを使用するか、実験的検証を行わずにゲノム内のギャップを特定するか [8,9,10,11,12,13]、または実験的検証を少数に集中させることにより、ゲノムデータから直接栄養要件を予測することが報告されています。株[14、15、16]。 これらの研究は微生物群集の相互作用ネットワークを予測するために使用されており、それは細菌群集における代謝の相互摂食を推測するのに役立っています[17]。 配列決定された細菌における補酵素、核酸塩基、およびアミノ酸の栄養要求性の頻度はコンピューター解析で推定されており、75% にも達する可能性があります [13]。ただし、これらの解析は実験的に得られたデータと比較すると高い偽陽性率を示す可能性があります。 18]。

栄養要求性植物は外部からのビタミンの供給を必要とするため、ビタミンの貯蔵を含む栄養要求性植物の生理学的適応またはその他の適応の問題が生じます。 栄養要求性乳酸菌がビタミンを除去した後も増殖を維持することは古くから知られていた[19]。 炭素、リン、窒素などの元素化合物の細胞内貯蔵は示されている[20、21、22]が、ビタミンや補酵素を含む小分子の貯蔵は現在十分に確立されていない。 また、環境中の細菌に潜在的な貯蔵庫がどの程度広がっているかも明らかではありません。 外部から資源にアクセスせずに増殖を維持する微生物の能力の生態学的影響により、多様な化合物の貯蔵を評価することに新たな関心が集まっている[23]。 補酵素の生合成に関与する遺伝子が変異した原栄養性大腸菌株、すなわち「人工」栄養要求性変異体は、必須ビタミンの除去後にわずか約1倍の貯蔵能力を有する[2]。 この 2 倍過剰な補酵素のプールは、おそらく、細胞分裂中の細胞増殖に対して代謝を堅牢に保つための最小要件です。 これらの結果から、補酵素の供給が不安定である可能性がある自然界で見られる栄養要求性生物については、栄養素の依存性と補酵素の貯蔵に対処するための異なる戦略が進化したのではないかという仮説が立てられました。 1 つの化合物の生合成が失われると、細胞の機能がより全身的に影響を受ける可能性があります。 生合成の喪失から生じる直接的な生理学的影響は、大腸菌、枯草菌、アシネトバクター・ベイリーなどのモデル生物で研究されており、フィットネス効果[4、13、24]や交差摂食の可能性[25、26]が含まれます。 これらの研究は、必要な栄養素が利用可能である限り、栄養要求株が野生型と競合することを示しています。 十分な進化時間が与えられれば、生合成能力の損失を補うために他の形質が選択される可能性があることが予想されます。 特定の生合成経路などの必須機能の喪失は、現在義務付けられている分野で利用可能な他の化合物や、栄養素不足に対処するのに役立つ機能にまで及ぶ可能性があります。 後者には、例えば、代謝経路における栄養要求性補酵素の使用の最適化、ビタミン貯蔵の増加、修復システムへのより多くのエネルギーの投資、または成長および栄養素の摂取速度の最適化が含まれる可能性がある[9、27、28、29]。

ここでは、自然界で生育するシロイヌナズナ植物の葉から単離された 224 株で構成される At-LSPHERE コレクションにおける栄養要求性の発生を最初に調査します [30]。 株はビタミンとアミノ酸が豊富な培地で分離されており、株コレクション内の栄養要求性を調べるための体系的な栄養素ドロップアウト実験が可能です。 次に、栄養要求性株が原栄養性株よりも高い補酵素貯蔵量を維持しているかどうかを検討し、栄養要求性と同時発生する（および潜在的に共進化する）ゲノム形質を調査します。 最後に、共培養実験でビタミンの獲得と栄養要求性の適応度を調べます。

この研究のために栄養要求性株を特定するために、代表的な 224 メンバー株コレクション (At-LSPHERE) をスクリーニングしました [30]。 簡単に説明すると、ビタミンまたはアミノ酸、両方の種類の化合物を含む、またはサプリメントを含まない液体培地を満たした 96 ウェル プレートで、各株の 3 つを培養しました。 ハイスループット光学密度 (OD600) 測定を成長の読み取り値として使用しました。 培地で増殖した156株のうち、50％（78株）が増殖にサプリメントを必要としたため、栄養要求性である可能性が高いことがわかりました（補足図1）。 栄養要求性は放線菌とアルファプロテオバクテリアで特に一般的であり、試験した菌株の半分以上が栄養要求性でした。 これらの78株から、個々のドロップアウト培地でのさらなる特性評価のために50の推定栄養要求株を選択したところ、ほとんどのビタミン栄養要求性はビオチン、チアミン、ナイアシン、およびパントテン酸に対するものであることがわかり、それぞれ10以上の栄養要求株が見つかりました（図1a;補足）図1）。

a 50株のドロップアウト培地でのスクリーニングにおいて、特定のビタミンが存在しない場合の増殖の欠如から推測される、同時発生するビタミン栄養要求性。 最も一般的に必要とされるビタミンは、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、チアミンでした。 エッジの厚さは、2 つの推定上の栄養要求性が同時に発生する株の数に対応します。 PABA = パラアミノ安息香酸。 (出典データ 1 の出典データ。) b 代表的な動的ビタミン枯渇実験。 成長は時間の経過に伴う倍増として表されます。 t = 0 で、4 つすべてのビタミンを補充した前培養からビタミン枯渇培地 (色線)、または対照として補充培地 (黒線) への切り替えを実行しました。 株が特定のビタミンに対して栄養要求性である場合、しばらくするとそのビタミンが枯渇して増殖が停止します。 たとえば、Aureiomonas Leaf324 は 4 つのビタミンすべてに対して栄養要求性であることがわかりました。 ビタミンを枯渇させた培養物とビタミンを補充した培養物が逸脱した時点は、3 つの複製すべてについて個別に折れ線グラフ上に視覚化されます (詳細については、「材料と方法」を参照)。 (ソース データ 2 のソース データ。) c 栄養要求性ヒートマップ。 明るい色は、それがないと菌株の増殖が補充された対照から逸脱し、したがって菌株が栄養要求性である化合物を指します。 たとえば、Aureiomonas Leaf324 の場合、各化合物を個別に使用しないと成長が停止したため、4 つの枯渇カラムはすべて明るい灰色になります。 (出典データ 3 の出典データ。) d 栄養要求性株における補酵素の貯蔵 (四分位範囲および中央値)。 示されたビタミンが存在しない場合の倍加数は、貯蔵容量に対応します。 (ソース データ 3 のソース データ)。

ソース データ 1 ソース データ 2 ソース データ 3 ソース データ 3.

多くの菌株の栄養要求量を並行して特徴付けることは有用ですが、個々の菌株の栄養要求量を解明するためのスクリーニングの適用は、プレートリーダーの線形範囲により制限され、誤った予測につながる可能性があります。 この制限を克服し、さらなる分析のために、液体培地での増殖時に凝集体を形成しないさまざまな門から 22 株を選択しました。これは、コロニー形成ユニット数が予想範囲内 (1e9 のオーダー) であることを視覚的に確認することによって確認しました。 /ml）（補足表1;補足表2の選択された株を参照）。 各菌株を半連続バッチ培養で培養し、10分間隔でOD600を監視し、2回の倍加ごとに各ウェルを新鮮な培地で希釈して、継続的な指数関数的増殖を確実にしました。 これらのデータを使用して、ビオチン、ナイアシン、チアミン、パントテン酸を補充したグルコース最少培地での各株の増殖を調べ、すべての株がこれら4つのビタミンの存在下で増殖することを観察しました（図1bの黒い軌跡と補足図） ２）。 続いて、細胞をビタミンを含まない培地に切り替えて増殖実験を実行し (方法を参照)、それによって細胞をビタミン枯渇にさらしました。 ビタミンドロップアウト培地での増殖が補充された対照培養物から逸脱した場合、特定の株を栄養要求株として分類しました（図1bの散布図と補足図2）。 したがって、この実験では22株すべてが栄養要求性であることが確認されました（図1c）。 具体的には、各株は平均して 2 つのビタミンに対して栄養要求性であり、株の 80% は複数のビタミンに対して栄養要求性でした。

細胞内では、ビタミンは補酵素に加工されます。 補酵素は触媒的に反応性が高く、しかも安定しています [2]。 補酵素またはその前駆体は代謝反応では消費されず、増殖による希釈を補うためにのみ合成されるため、細胞内に保存できる可能性があります。 選択した栄養要求性株の細胞内ビタミン貯蔵の可能性を評価するために、半連続増殖データを使用して、ビタミン欠乏後に各株が指数関数的増殖から逸脱する前に達成した倍加の総数を計算しました（補充された対照培養との比較によって決定）（図） .1b;補足図2)。 したがって、これらの値はビタミンの貯蔵量の指標として役立ちます。 私たちは、ほとんどの菌株が 1 ～ 2 回の倍加を可能にするビタミン貯蔵能力を持っていることを発見しました。これは大腸菌変異株と同様です [2]。 しかし、一部の栄養要求性株はビオチン除去後も長期間にわたって指数関数的な増殖を維持し、これはビオチンの貯蔵量（16～32倍の過剰プール）を使用して4～5倍増に相当することも観察しました。 1つの菌株であるクリセオバクテリウム・リーフ201は、ビタミン除去後に9回の倍加（512倍過剰）を可能にするリザーバーを持っていました（図1d）。 また、Rhizobium Leaf68については、増殖停止が補酵素の細胞内枯渇と同時に起こることを例示的に確認しました（補足図3）。

検証された 22 株のビタミン要件がわかったので、次に、オルソロガス グループ オブ タンパク質 (COG) アノテーションを使用してビタミン生合成経路を分析することにより、観察された栄養要求性の潜在的な遺伝的根拠を特定することに着手しました。 原栄養性対照として、サプリメントなしの最小培地で増殖することを確認した追加の13株を研究しました（補足図4）。 まず、観察された栄養要求性をゲノムデータのみから予測できたかどうかを尋ねました。 経路に存在しない生合成遺伝子の割合が栄養要求性のマーカーとして使用されている以前の報告[12、13、14、15、31]に続き、本発明者らは4つの補酵素合成経路すべてに存在する生合成COG用語の割合を研究した。 原栄養株を含むすべての株には、研究した4つの補酵素（ビオチン、チアミン、コエンザイムA、NAD）すべての経路に多くの生合成ステップが欠けており、栄養要求株で体系的に経路ステップが少ないことは観察されませんでした（図2）。 次に、個々の遺伝子の有無から栄養要求性を推測することで、実験的に検証された栄養要求性の予測が改善されるかどうかを尋ねました。 この目的を達成するために、カイ二乗検定を使用して、ビタミン生合成経路の各 COG タームが栄養要求性グループと原栄養性グループに存在する頻度を比較しました。 このようにして、それぞれの栄養要求性を説明するのに十分な 1 ～ 3 個の欠落遺伝子を同定しました (表 1)。 特定の反応の性質の詳細については、補足ノート 1 を参照してください。

a 各株（列）に存在する各補酵素生合成経路（行）の COG タームの割合。 株は門ごとに色分けされ、存在する経路のパーセンテージによってクラスター化されます。 黒い長方形は、対応する株がこの研究で補酵素に対して栄養要求性であることが判明したことを示します (図 1)。

観察された各栄養要求性の原因と思われる1〜3個の遺伝子を特定した後、その結果がAt-LSPHERE株コレクション内の残りの栄養要求性株にも当てはまるかどうかを調査しました（補足図1cおよび図1a）。 これを達成するために、観察された 4 つの栄養要求性要件のそれぞれに対して堅牢な分類器を作成したいと考えました。 まず、63の栄養要求性株のサンプルを生成し、そのうち35株については上記で検証され、追加の28株については補足図1cからの予測がターゲット変数として使用されました。 次に、カイ二乗分析 (表 1) で選択された 1 ～ 3 個の特徴、またはランダムに選択された同数の特徴のいずれかに基づいて、決定木分類器をトレーニングしました。 これらのモデルは、80 ～ 100% のパフォーマンス指標に達しました (補足図 5)。 このモデルを使用して、補足培地で増殖が観察され（したがって、生理学において同等である）、COG注釈が利用可能なAt-LSPHEREコレクションからの139株の栄養要求性を予測しました（補足表3）。 また、これらの特徴を使用して、分類レベルで栄養要求性を再調査しました。 分析では存在しないと我々が特定した COG タームは、根粒菌属に密接に関連する放線菌およびアルファプロテオバクテリアにおける栄養要求性の推定系統学的濃縮を再現しました。 (補足図6;補足図1と比較してください)。

ゲノムの減少は、環境栄養要求性細菌において以前に報告されている[32]。 したがって、機能的ゲノムの注釈と規定の培地で観察された増殖に基づいて栄養要求性の予測が可能であった139株のゲノム減少と潜在的な付随遺伝子喪失イベントに取り組みました（補足図6）。 実際、原栄養株と比較した場合、栄養要求株ではゲノムが著しく小さいことがわかりました（図3a）。 それにもかかわらず、この効果はクラス/門に依存していました。ゲノムの減少は放線菌で顕著であり（ゲノムが19％小さい）、そのため株の高い割合（>50％）が栄養要求性です（補足図1b）。 分析された菌株にはファーミキューテス属が 6 種しかないため、一般的な結論を導き出すのは困難です。 ただし、4つの栄養要求性株は、2つの原栄養株の半分のサイズしかないゲノムを示し、オープンリーディングフレームが少ないことも特徴です（補足図7）。 ここで特定された栄養要求性株は、平均して2つのアミノ酸と2つのビタミンを必要としました（図1、補足図1）。 したがって、観察された生合成遺伝子の損失は、栄養要求株のゲノムが0.25％小さいことに起因すると考えられます（平均5,000個の遺伝子をコードする細菌の場合、図3aに基づいて推定）。 したがって、栄養要求性のゲノムがより小さいという我々の観察は、ゲノム減少を説明する他の栄養要求性関連の生物学的プロセスまたは経路が存在するかどうかという疑問を引き起こす。

ソースデータ 5 のアクセッション番号を持つ RefSeq から取得したゲノム。すべてのパネルに、液体培養で増殖し (補足​​図 1)、COG 注釈が利用可能な 139 株が含まれていました。 栄養要求性の状態は、図 2 と表 1 のモデルを使用して予測されました。 a 栄養要求性と原栄養性の間のゲノム サイズ。 b 各補酵素について栄養要求性と原栄養性の菌株における各ビタミン由来補酵素を必要とする反応の数 (x 軸) (別のプロット)。 たとえば、左上の最初のプロットは、ビオチン栄養要求株と原栄養株の間での 6 つの補酵素の補酵素使用量の比較を示しています。 代謝モデルは、RefSeq アクセッション番号に対して CarveMe [33] を実行することによって取得されました。 c 各ビタミンの栄養要求性と原栄養性の間で遺伝子の > 20% が異なって存在する経路。 ここで、「過小評価されている」とは、栄養要求性物質の量が少ないことを指します。

ソースデータ 5.

栄養要求性とゲノム減少を結び付けるゲノム適応として考えられるのは、栄養要求性株が合成できない補酵素への依存度が低くなるように進化したということである。 しかし、逆のシナリオも考えられます。ビタミンが環境中で自由に入手できる場合、安価なビタミンから補酵素を好むという正の選択圧力が生じる可能性があります。 特定の補酵素の栄養要求性と、酵素の数に関してその補酵素の使用との間に相関関係（正または負）があるかどうかを調査するために、すべての個別の株のゲノムスケールの代謝モデル（GEM）を作成しました[33]。 全体的に、代謝モデルの反応数は両方のグループで同様であり（補足図7）、栄養要求性が合理化された代謝ネットワークを持たないことを示しています。 私たちは、栄養要求性株が酵素反応において一方の補酵素を他方よりも優先的に使用するかどうかを調査することにしました。 特に、ナイアシン栄養要求株は、NAD(P) 依存性酵素の代わりに、FAD または FMN 依存性酵素を使用する可能性があります。 GEMを使用して、栄養要求株と原栄養株の両方について各補酵素を必要とする酵素の数を計算し、株が対応するビタミンに対して持つ依存度を測定しました。 GEM には、問題の個々の酵素の発現レベル (したがって、酵素の潜在的な異なる要件) に関する情報は含まれていませんが、GEM の化学量論的制約とネットワーク構造により、ゲノム解析のみよりも遺伝子発現の信頼性が高くなります。 ほとんどの補酵素では、栄養要求株と原栄養株の反応数が同じであることがわかりました（図3b）。 ナイアシン栄養要求株は、NAD(H) を使用すると酵素が 10% 増加し、FAD(H) が使用される酵素が 20% 減少しました (p 値 <0.05、χ2 検定)。これは、生合成が失われる補酵素を使用することを好むことを示しています。 ビオチンに関しては、栄養要求性株はビオチン依存性酵素を 15% 多く持っていました (p 値 <0.05、χ2 検定)。 全体として、この分析は、栄養要求性株で観察されたゲノム減少は、それぞれの補酵素を必要とする酵素の数が少ないことによって体系的に説明できないことを示しています。 そのため、栄養要求性生物の代謝能力は低下しない可能性があり、栄養要求性生物は代謝反応を必須ビタミンの使用に割り当てている可能性があります。

補酵素の使用に対する直接的な影響とは別に、栄養要求性株は栄養要求性になる前または後のいずれかで、補酵素の使用に間接的に関連する他の形質を進化させた可能性があると我々は推論した。 このような形質は、他の生合成経路における機能の喪失を伴う可能性があるほか、炭素源の利用など、限定されたニッチ領域では必須ではない遺伝子の喪失を伴う可能性がある。 したがって、私たちは代謝の再配分をより一般的に扱おうとしました。 存在が栄養要求性と相関する遺伝子を見つけるために、我々はゲノムワイドな機能ゲノム解析を実施しました。 まず、各 COG タームが栄養要求性と原栄養性の間で差次的に豊富であるかどうかを評価し、次に有意に異なる COG タームを経路にマッピングしました。 有意性はχ 2 検定によって決定され、FDR を使用して複数の検定補正が実行されました。 このようにして、栄養要求性と原栄養性の間の一連の保存された差異を特定しました（図3c、補足表4）。 全体として、このパターンは栄養要求性細胞の機能喪失が大半を占めていました。 差次的に豊富な COG 用語のカットオフをすべての経路遺伝子の 20% に設定して、既知の各栄養要求性の生合成経路を回復しました。これにより、このアプローチがグループ間の生物学的に意味のある差異を捕捉できることが確認されました。 他の遺伝子の欠損は、エネルギーにおける酵素機能、特にグルコース代謝や、ここでテストしたもの以外のアミノ酸や他の補酵素などの他の生合成経路の喪失を伴う一方、サルベージシステムは栄養要求性グループでより一般的であった。

共培養実験は、微生物群集における細菌の相互作用についての洞察を提供するために使用できます [34、35、36、37]。 ここで我々は、栄養要求株が共培養された原栄養株からビタミンを入手するかどうかを尋ねた。 この目的を達成するために、系統発生的に代表的なビタミン要求性（n = 10）および原栄養性（n = 10）株を共培養実験用に選択しました（図4a）。 我々は、20 mM グルコースおよび 20 種類すべてのタンパク原性アミノ酸 (それぞれ 100 μM) を補充した最少培地中で、菌株ミックス (それぞれ 3 つの技術的複製で 3 つの生物学的複製) の連続希釈実験を実施しました。 メディアの違いは、ビタミンが補充されているかどうかだけです。 (図4b、c)。 培養物は、細菌種の相対組成を決定するために、16S rRNA 遺伝子配列決定によって定期的に分析されました。 両方の条件での成長は同等でした (図 4c)。 培地間の相対存在量プロファイルは、両方のグループ、つまり栄養要求株と原栄養株で同様であり、ビタミンが補充されたかどうかとは無関係であることが観察されました（図4d、各株の灰色とオレンジ色の列、補足図8）。 ビタミン補給の恩恵を受けた唯一の栄養要求性種は、Pedobacter Leaf132 でした (p 値 0.003、rm-ANOVA)。 2 つの栄養要求性株、Rhizobium Leaf202 および Arthrobacter Leaf137 は、ビタミンが補充されていない培養物中でより高い相対存在量を示しました (p 値 <0.01 rm-ANOVA)。 したがって、この分析は、原栄養株が存在する群落で栽培される場合、外部からのビタミン補給の欠如は栄養要求性株の成長を妨げないことを示し、ビタミンの交差摂食を示唆しています。

a 共培養用の株の選択。 シロイヌナズナの葉微生物叢の系統的多様性を表すために、合計 20 の菌株が選択されました。 クラスタリングは、全長 16S rRNA 遺伝子配列に基づいています。 b パネル A に示す菌株を、3 つの生物学的接種材料に同数混合しました (詳細については「方法」を参照)。 各接種材料を使用して、ビタミンを含む最小培地とビタミンを含まない最小培地という 2 つの増殖計画下で 3 つの技術的複製を接種し、18 個の培養物が得られました。 20 種類のタンパク質構成アミノ酸すべてをすべての培養物に添加しました (100 μM)。 c からの培養物の増殖測定 b 培養物を合計 120 時間増殖させ、24、48、および 72 時間で希釈しました。 9、24、48、72、96、および 120 時間 (点で示す) の時点で、16S rRNA 遺伝子配列決定 (細胞) および LC/MS (上清) 用のサンプルを採取しました。 d 共培養実験における全 20 株 (カラム) の相対存在量。 各株について、各生物学的複製の 3 つの技術的複製の平均が、前の時点と比較した相対存在量の変化として示されます。最初はビタミンを含む最少培地 (オレンジ色のボックスでラベル付けされた列)、次にビタミンを含まない最少培地です。 (灰色のラベルが付いている列)。 各株について、同じ条件の 3 つの複製は細い白い線で区切られ、2 つの条件は太い灰色の線で区切られます。 20 株は黒い太い線で区切られています。 16S rRNA 遺伝子アライメントから計算された系統発生により、株がクラスター化されます。

交差摂食の存在を評価するために、上記の共培養からの使用済み培地を検査しました (図 5)。 細菌を含まない培地（0 時間時点）と、9 時間および 24 時間の共培養後の上清を測定しました。 まず、2 つの条件 (± ビタミン) でビタミン プールを比較しました。 ビタミンを補給すると、ナイアシン、パントテン酸、チアミンの濃度は0時間から9時間の間、さらに9時間から24時間の間に減少し、培地で増殖した細菌による正味の摂取が示唆されました（図5aのオレンジ色のシリーズ）。 接種された菌株の半数がそれらの 1 つ以上に対して栄養要求性であったことを考慮すると、これら 4 つのビタミンのビタミン プールの減少が予想されました。 しかし、ビオチン濃度は、ほとんどすべての株が栄養要求性であるにもかかわらず、実験中に減少しませんでした（図5aの最初のパネルのオレンジ色のシリーズ）。これは、栄養要求株によるビオチンの取り込み速度が小さいか、または原栄養株がビオチンを分泌したことを示しています。その速度は栄養要求性株によるビオチンの取り込みに匹敵します。 また、どの菌株も栄養要求性ではなかったピリドキサールの取り込みも観察されました。 リボフラビン濃度は、細菌を含まない培地では検出限界を下回っていましたが、細菌の増殖中に培地中に一貫して蓄積しており、共培養中の少なくとも 1 つの株が他の株よりも多くのリボフラビンを分泌したことを示唆しています。 ビタミンが枯渇した培地では、9 時間でナイアシン、パントテン酸、ピリドキサールの蓄積が見られ、その後 24 時間でこれらのビタミンが減少しました。これは、細菌が最初にこれらのビタミンを培地に分泌し、その後それらを取り込んだことを示唆しています (図 5a、灰色のシリーズ)。 チアミンとビオチンのプールは検出限界未満のままでした。 両方の培地で補充されたアミノ酸（単一の主要な炭素源としてのグルコースとともに）は、純粋な培地と比較した場合、すべての共培養物で減少し、培地からの正味の取り込みを示しました（図5b）。 提供されたグルタミン酸塩 (魅力的な炭素および窒素源 [38]) の大部分は、9 時間の共培養後もまだ利用可能であり、主に定常期に消費されました。

a 共培養上清から測定した、共培養におけるビタミン消費の時系列。 各ビタミンについて、総イオン電流の正規化ピーク面積の log10 が最初にビタミンを補充した培養物で示され、次にビタミンが枯渇した培養物で示されます。 b 共培養上清から測定されたアミノ酸。 データは、両方の培地（+ および - ビタミン）にアミノ酸を補充した培地からのシグナルに対して正規化された log10 変換されたピーク面積です。 ヒートマップの各セルは、9 つ​​の複製の平均を表します。

栄養要求性変異体は、ペアごとの競争実験において原栄養性祖先株よりも適応度が優れていることがよくあります [13、24、39]。 次の分析では、これが自然の栄養要求株と原栄養株の群集環境にも当てはまるかどうかを評価しました。 具体的には、個々の培養における各株の増殖速度と収量から種の豊富さを予測し、これらの予測を実験的に得られたデータと比較しました（図4）。 ビタミンを補充した最少培地（図4dのオレンジ色の列）の相対存在量データの分析を、種の豊富さ（検出された種の数を最初に共培養に導入された種の数で割ったもの）を時間の経過とともに比較することによって実行しました。 2 つのグループ: 栄養要求性生物と原栄養性生物。 菌株の 3 分の 2 が検出されず、最初の 2 回の希釈サイクル (24 時間後と 48 時間後) の後、最終的に 72 時間で安定する前に失われたと解釈されることがわかりました (図 6a)。 原栄養株グループではより多くの菌株が失われました。原栄養株の4分の3が48時間後に検出されませんでしたが、半分のみが検出されなかった栄養要求株よりも大幅に少なくなりました（p≪0.001、rm-ANOVA、図6a）。 栄養要求株と原栄養株の間で統計的に異なる結果が予想されるかどうかを調査するために、我々は単一栽培における成長に基づいて種の豊富さを予測することを試みました。 この目的を達成するために、共培養実験に使用したのと同じビタミンを添加した培地で増殖パラメータを実験的に決定しました（図6b）。 これらのデータを使用して、消費者資源モデルをパラメータ化し、ビタミンを添加した共培養における各菌株の予想存在量をシミュレートしました。 簡単に言うと、グルコース濃度はバッチ培養における最終的な炭素制限をシミュレートするために繰り返し更新され、増殖速度は Monod 反応速度論に従って更新され、種間の相互作用は含まれていませんでした (モデリングの詳細については「方法」を参照)。 シミュレートされた存在量から、理論上の種の豊富さを計算しました。 原栄養グループでは、シミュレーションが実験的に観察された種の豊富さを定性的に捉えており（図6cの濃い青の線と比較した水色の線）、最終的な種の豊富さを正確に予測したことがわかりました。 原栄養株と比較して成長速度と収量が低いため、予想どおり、すべての栄養要求性種はシミュレーションで失われました（図6cの濃い赤の線と比較して明るい赤の線）（図6b）。

a ビタミンを添加した培地で培養された共培養における種の豊富さ。 出典データ 6 の出典データ。 b ビタミン添加培地で生育する各株の生育速度と収量 (= 保持能力) を実験的に決定しました。 成長率のソースデータはソースデータ 9 に、収量のソースデータはソースデータ 10 です。 c–f 消費者資源モデルによってモデル化された種の豊かさ。 モデルのエラーバーは、次のように感度分析によって取得されました。 c と d では、細菌が「存在」としてカウントされる閾値は、総存在量の 0.1% から 1% まで変化しました。 e では、第 2 炭素源を分泌するように設定された細菌の増殖速度の閾値は、0.3 h-1 (n = 15) から 0.6 h-1 (n = 3) の間で変化しました。 f では、第 2 炭素源を優先的に使用する栄養要求体の有効性は、原栄養体の有効性の 2 倍から 5 倍まで変化しました。 ソースデータはソースデータ6にあります。

ソースデータ 6 ソースデータ 9 ソースデータ 10.

消費者資源モデルと実験データの間には明らかな矛盾があるため、モデルの拡張によって観察された種の豊富さを捉えることができるかどうかを検討するようになりました。 私たちは、最初のモデルには含まれていなかったビタミン相互摂取用語を実装することから始めました。 エキソメタボロミクス測定 (図 5) から、原栄養生物が培地にビタミンを分泌し、それによって少なくとも一時的にそのビタミン濃度が増加することがわかりました。 さらに、ビタミンを添加しなかった培養物に由来するサンプルの 16S rRNA 遺伝子配列決定により、原栄養株との共培養中に観察されたビタミン濃度の増加が栄養要求株の増殖をサポートするのに十分であることが示されました（図 4）。 成長培地中のビタミン濃度が炭素制限前に成長を制限するほど低くなった場合、これらの追加のビタミンにより収量が増加した可能性があります。 この目的を達成するために、生理学的に関連するビタミン濃度の範囲で増殖データを取得しました（補足図9）。 成長速度と収量の両方において観察された差は、一般に小さかった。 それにもかかわらず、消費者リソースモデルにおける各株の増殖を、1 μM ビタミンでの各株の増殖パラメーターから 10 μM ビタミンで増殖させた場合の増殖パラメーターに変更し、それによって潜在的な早期増殖停止の可能性を減らしました。 我々は、このシミュレートされたビタミン濃度の増加が、予測された栄養要求性種の豊富さの増加をもたらさないことを観察しました（図6d）。

ビタミンの相互摂取による消費者資源モデルは、実験的に観察された種の豊富さの違いを捉えていませんでした（図6d）。 共培養の栄養要求性グループの栄養価が高い別のシナリオは、代謝副産物を炭素源として利用する可能性があるということです。 好気的条件下であっても、多くの急速に増殖する細菌は炭素源を発酵させ、ピルビン酸、酢酸、コハク酸などの副産物を分泌することが知られています[40、41]。 したがって、定常期（9時間と24時間、および96時間と120時間の間）中の群集組成の変化は、主な炭素源であるグルコースが消費された後の代謝副産物の（共）消費によるものと考えられます。 このシナリオに対処するために、我々は、急速に成長する原栄養株による酢酸などの化合物の分泌を効果的に模倣する 2 番目の炭素源をモデルに導入しました (図 6b)。 次に、すべてのゆっくりと成長する株を、この新たに利用可能なリソース上で、グルコースでの成長速度に比例した速度で成長させました。 低速成長グループでは栄養要求株が豊富であったため、副産物を優先的に使用することができましたが、低速成長の境界条件が満たされていることを考慮すると、原栄養グループには分泌基質上で成長する平等なチャンスを与えました（補足図を参照）濃度と総細胞数に対する影響の詳細については 10）。 炭素相互供給項を追加すると、元のモデルと比較して実際に予測が改善されました。 両方のグループは種の豊富さを失いますが、どちらのグループも完全に失われるわけではなく、種の豊富さは最終的に安定します（図6e）。 しかし、このモデルは依然として、原栄養グループの最終的な種の豊富さがより高いと予測しています。 したがって、我々は、栄養要求株の基質親和性を高めることにより、新たに利用可能な炭素源への優先的なアクセスを与えた。 このシナリオでは、モデルは実験的に決定された定性的なダイナミクスを捕捉しました（図6f）。 総合すると、この分析は、炭素源の相互供給能力の向上が、共培養における栄養要求性株の成功を決定することを示唆しています。

補酵素は遍在しているだけでなく、一般に生命のあらゆる領域にわたって保存されています。 これらはタンパク質の触媒ツールボックスを拡張し、有機酸および 1 炭素単位のキャリア分子として機能します [1]。 今回我々は、シロイヌナズナの葉圏から単離した環境細菌の栄養要求性を特徴づけ、ビタミン合成能力の欠如と併発するゲノム的および生理学的形質を調査した。 私たちは、ビタミン要求性がビオチン、ナイアシン、パントテン酸、チアミンに共通していること、そして栄養要求性がそれぞれの生合成経路上の特定の遺伝子の欠如と体系的に関連していることを発見しました。 他の研究では、この研究で特定された遺伝子の一部が他の栄養要求株では欠如していることが報告されています[7、8]が、栄養要求性が一般的にこれらのいくつかの特定の遺伝子の喪失によって引き起こされるかどうかを評価するには、さらなる研究が必要です。 さらに、我々の実験分析およびバイオインフォマティクス分析により、さまざまな天然栄養要求性細菌分離株における一連の栄養要求性特異的機能、ならびに補酵素の交差供給および貯蔵が明らかになりました。

菌株が生合成経路を失うと、その栄養素の外部供給源に依存するようになります。 したがって、そのニッチは、このリソースに少なくとも時々アクセスできる人に限定されます。 したがって、株の集団は、強制されたニッチが供給できるすべての化合物を合成する能力を失う可能性があります。 実際、確認された5つの栄養要求株のうち4つで複数の栄養要求性が観察されています(図1)。 栄養素の相互摂取は共存を促進することが以前に示されています[42]。 2 株系では、「受益者」株 (合成損失変異体) は、栄養素を供給する「補助」株と競合しませんでした。 同じ栄養素を供給する 3 番目の株が関与している場合、受益者株はヘルパー株を上回りました。 したがって、交換された 1 つの代謝産物は、2 つの株からなるコミュニティを安定化するだけである可能性があります。 自然界で見られるコミュニティには、数百または数千のメンバーがいる場合があります。 したがって、大規模な群集を安定させるための交差摂食相互作用には、各栄養要求性株に複数の栄養要求性が必要です。 栄養要求性植物の 80% で複数の栄養要求性が観察されているため、それらは交差摂食によって観察される群集の安定性に寄与している可能性があります [30, 43]。 したがって、必要な化合物の正体はニッチによって決定されるが、株あたりの栄養要求性の数はむしろ群集の固有の特性であると我々は提案します。 大部分が貧栄養性であるが、葉の表面には検出可能な量の炭素源 (グルコース、メタノール、スクロース、フルクトース) [44]、アミノ酸、さらにはビタミンが存在し、これらは植物宿主自身またはニッチに生息する細菌のいずれかによって利用可能となる [6] 、45、46]。 代謝コストの高いビタミンB12（植物の代謝には使用されない）の栄養要求性は観察されませんでした（補足図11）。

細菌集団のゲノムは、環境によって設定された選択圧に応答して、またランダム効果、たとえば遺伝的浮動として変化します。 例えば、多様な化合物の生合成には、エネルギー（主にATPと酸化還元補酵素）およびタンパク質合成の観点から細胞資源の割り当て、つまりコストが必要です。 そのような生合成プロセスの生成物が環境内で入手可能であれば、その化合物の生合成能力を失った生物はコストを回避できます。 多くの研究では、生合成のコストを回避することによって細胞は適応度の利点を獲得し、それによって生合成の喪失による選択的な利点が可能になると主張されています。この理論は黒の女王仮説と呼ばれています [4、13、39]。 ただし、生合成の喪失は遺伝的浮動によって引き起こされる可能性もあります。 より小さなゲノムは、豊かな生育環境から分離された細菌でよく観察され、内部共生および寄生のライフスタイルと強く関連しています [32、47、48、49]。 しかし、観察されたゲノム減少に基づいて選択と遺伝的浮動の間のメカニズムを推測することは不可能です。

ゲノム縮小は 2 つの方法で発生します: 1. 一般的なゲノム縮小と 2. 特定の遺伝子の喪失 [42]。 この研究では、遺伝子の特異的および全体的な欠如の両方が観察されました。 しかし、ゲノム減少の大部分は最初のカテゴリーに当てはまり、栄養要求株では最大19％小さいゲノムが観察され、そのうちの1％未満は栄養要求性に直接関連する遺伝子の欠如によって説明できます（図2および3）。 。 また、特にナイアシン栄養要求性において、ゲノムおよび代謝の再配分も観察されました（図3b、c）。 私たちの分析はまた、栄養要求性細菌は、原栄養細菌よりも栄養要求性のビタミン（特にビオチンとNAD）を必要とする酵素を多く持っていることを示しています（図3b）。 この観察は、代謝回転の増加や補酵素の必要性を意味するものではなく、ビタミンの制限によってどれだけ多くの反応が阻害される可能性があるか、したがってビタミンの制限が代謝ネットワークに与える影響を意味しています。 要件自体が一定のままであるか、あるいは減少さえしているかは、遺伝子が翻訳される程度に依存します。 我々は、依存性の程度（ここでは補酵素を使用する酵素の数によって定義される）は、原栄養者に影響を与えるほど栄養要求性には影響を及ぼさないのではないかと仮説を立てる。これは、原栄養者はビタミン生合成のコストにより補酵素への依存性を最小限に抑える可能性があるためである。

経路内に存在する生合成遺伝子の割合は、細菌を栄養要求株または原栄養株に分類するためによく使用されます [10、13、16]。 我々の結果は以前に発表された研究[18]と一致しており、遺伝子の頻度に基づいて栄養要求性を予測すると不正確な予測になることが示唆されています。 また、ゲノム全般、特に補酵素生合成経路におけるランダムなギャップは頻繁に観察されるが、経路ごとに1～3個の特定の補酵素生合成遺伝子の欠如が観察された栄養要求性と強く関連していることも観察しました（図2、表1）。 ここで特定した遺伝子の一部の喪失は、以前からすでに栄養要求性と関連付けられていました[7、8]。 栄養要求性がいくつかの特定の遺伝子の喪失によって普遍的に引き起こされるかどうかは未解決の疑問のままです。 したがって、ゲノムデータに基づく栄養要求性の予測精度は、たとえば、栄養要求性で一般的に失われることが知られている遺伝子に高い重みを与えることによって改善される可能性がある。 この研究では、選択した特徴を使用してモデルをトレーニングすることにより、80 ～ 100% の精度、再現率、精度で栄養要求性を予測できました (表 1)。

いくつかの栄養要求性株ではビオチン制限に対するより高い堅牢性が観察されました（図1）。これは、貯蔵メカニズムに関する疑問を生じさせます。 哺乳類では、ビオチンの貯蔵はミトコンドリアのアセチル-CoA カルボキシラーゼと関連している[50]。 ビオチン栄養要求性酵母では、ヒストンのビオチン化が、ヒストンをビオチン化しないビオチン原栄養性酵母サッカロミセス・セレビシエとは対照的に、栄養要求性カンジダ・アルビカンスにおける潜在的なビオチン貯蔵庫として機能することが示唆されている[51]。 最も単純に言えば、貯蔵は非特異的であり、補欠分子族としてビオチンに共有結合するタンパク質間に分散する可能性がある。 この仮説は、ビオチン栄養要求株の代謝ネットワーク内にビオチンを必要とする酵素がより多く含まれているという観察によって裏付けられています（図3b）。 ビオチン依存性酵素の数の増加が細菌における貯蔵戦略であるかどうかはまだ検証されていないが、ビオチン結合リザビジンが根粒菌種のビオチン貯蔵に役立つことを示した最近の研究によって裏付けられている[52]。

栄養要求性は進化において頻繁に発生し、この研究では、シロイヌナズナの葉の微生物叢内のすべての主要な門で栄養要求性を特定しました。 さらに、この研究（図4〜6、補足図8）では、他の研究と同様に、ビタミンを含まない原栄養者との共培養でも栄養要求性が存続することを観察しました[12、14、16]。 これらの観察は、栄養要求性物質が微生物群集の集合において指定された役割を果たしているのかどうかという疑問を引き起こします。 代謝の非類似性は、少なくとも理論的には、また一部のアミノ酸の場合には、交差摂食を引き起こす可能性がある[26]。 栄養要求株と原栄養株が代謝的および系統発生的に互いに異なることが判明したため、私たちの結果はこの考えを裏付けています。 この研究では、栄養要求株がビタミンを提供する原栄養株と一緒に栽培されている場合、ビタミンの不在下でも栄養要求株がその個体数を十分に維持していることを確認しました。 したがって、成長を再開するのに十分なビタミンが分泌されるまで、栄養要求株は成長停止状態にあり、このライフスタイルによって選択圧力が他の菌株によって放出される代謝副産物の効率的な消費に移行するのではないかと我々は仮説を立てています。

私たちは、栄養要求性株が、ビタミンを補給した共培養において、個別培養での増殖から予想されるよりも成功することを発見しました。 実験的に得られた成長率と炭素相互供給項を含む収量データによってパラメータ化された消費者資源モデルは、この観察を十分に捉えています。 原栄養株が十分な量のビタミンを分泌するまで栄養要求性株の増殖は再開できないため、ビタミンと一緒に分泌される炭素源を優先的に使用することで、栄養要求株に競争力を与えることができる可能性がある。 私たちの発見と推論は、消費者資源モデルの枠組みで非特定の炭素相互供給条件を導入することによって安定した共存が説明され、そのような代謝副産物による成長は多くの場合一次炭素による成長に匹敵するという以前の結果と一致しています。グルコースなどの供給源[35]。 私たちの枠組みは、そのような代謝促進が共存を促進するだけでなく、炭素副産物の優先的消費も競争排除を回避するための実行可能な戦略となる可能性があることを示唆しています。 総合すると、我々の結果は、栄養要求性が他の細菌の代謝産物の消費に特化したライフスタイルの一部であり、したがって微生物群集の一部である自由生活細菌にとって有益である可能性があることを示唆しています。

この研究で使用されたすべての At-LSPHERE 株は以前に発表されたものです [30]。 すべての増殖アッセイは、At-LSPHERE 株の場合は 28 °C、大腸菌 [53] 株の場合は 37 °C で実行されました。 振盪フラスコ培養物の濁度は、Biophotometer Plus (Eppendorf) を使用してセミマイクロキュベット (Bio-Greiner) 内で 595 nm での光学密度 (=「OD600」) を測定することによって決定されました。 OD 測定値を直線範囲内に保つために、サンプルを必要に応じて希釈しました。 96 ウェル プレート (TPP 平底) の連続 OD モニタリングによるバッチ培養では、Tecan Infinite M200 Pro を振幅 1 mm の軌道振盪で使用しました。

媒体ベースは、無機塩（１．６２ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を含むリン酸緩衝液（２．４ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．０８ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）であった。 グルコースを20 mMで、ピルビン酸を40 mMで添加した。 すべての培地成分について、10x ストックを調製し、ddH2O に溶解し、ろ過滅菌しました。 以下の濃度で示されている場合、ビタミンを補給しました: D-パントテン酸ヘミカルシウム塩 1.05 μM、ビオチン 0.41 μM、リボフラビン 1.06 μM、チアミン・HCl 1.19 μM、ピリドキサール・HCl 0.98 μM、p-アミノ安息香酸 1.09 μM、コバラミン 0.14 μM、リポ酸 0.24 μM、ナイアシン 1.22 μM、葉酸 0.23 μM。 L-トリプトファンとL-チロシンを0.05 mMで補充したことを除き、20種類のタンパク質構成L-アミノ酸すべてをそれぞれ0.1 mMで補充しました。 100倍のストックが調製されたリボフラビンとトリプトファンを除く、他のすべてのビタミンおよびアミノ酸については1,000倍のストックが調製されました。

ln 変換されたデータの線形回帰は、sklearn の line_regression 関数を使用して実行されました。 対数線形スケールの外側にあるデータポイントは省略されました。 増殖率は、対数期で少なくとも 2 回の倍加を行った培養物についてのみ計算されました。

枯渇実験（図1および補足図2を参照）では、以下の基準が満たされた場合、ビタミンを含まない培地で培養された細胞の増殖は、補足された対照から逸脱していると定義されました。 ビタミンを含まない培養物とビタミンを添加した培養物では、倍加の合計数に少なくとも 0.25 倍の差がなければなりません。 さらに、3 回の反復のうち少なくとも 2 回では、0.25 倍加分離後の増殖速度を 25% 低下させる必要がありました。 残りの反復では、10% の減少は許容可能であると考えられました。 保存期間は、この時点でビタミンなしで行われた菌株の倍加回数として定義されました。 固体Ｒ２Ａ培地はＳｉｇｍａから入手した。

At-LSPHERE コレクション [30] 内の 224 菌すべてを 4 つの培地 (+ ビタミンおよびアミノ酸、-サプリメント、+ アミノ酸および + ビタミン) での増殖についてスクリーニングするために、各菌株を固体 R2A から液体 R2A に接種しました。プレートに置き、定常期まで増殖させます (24 時間)。 次に、定常期の前培養物 10 μl を 4 つの培地それぞれ 190 μl に接種し、220 rpm シェーカー上で 28 ℃ で一晩前培養し、3 回の生物学的複製を行いました。 主培養物に同じ方法で接種し、t = 0 および t = 24 時間の 2 つの時点で OD 測定を行いました。 OD を対照 (無細胞、培地充填) ウェルの OD に対して正規化しました。 50 株のドロップアウト スクリーニングでは、同じプロトコールをいくつかの変更を加えて繰り返しました。 ここでは、R2A での定常期の前培養 5 μl を、4 つの培地 (+ ビタミンおよびアミノ酸、-サプリメント、+ ビタミン、+ アミノ酸) および 30 種類のドロップアウト培地のそれぞれ 45 μl に接種しました。 (ソースデータ 1 の個々の化合物) を一晩前培養し、再び本培養に使用します。 24 時間ごとに、5 μl の定常期培養液を固体 R2A プレートに移し、コロニーの色および形態を各菌株の既知の特徴と比較して、汚染を排除しました。

各菌株を、96ウェルプレート上の固体R2Aプレートから、生物学的三重反復および5つの技術的反復で、20アミノ酸および4種類のビタミン（チアミン、ナイアシン、ビオチン、およびパントテネート）を200μlの培養体積で補充した培地中で接種した。 翌日、各細胞培養物 10 μl を新鮮な培地に希釈することにより、主培養物を調製しました。 一晩培養した後、後期指数関数的段階に達しました。 5 つの技術的複製を一緒に滅菌 2 ml エッペンドルフ チューブにプールし、細胞懸濁チューブを遠心分離 (10,000 rpm、2 分間) し、上清を除去し、細胞ペレットを 1.5 ml の滅菌 MgCl2 に溶解することによって 2 回洗浄しました。 2 回目の洗浄後、前述と同様に遠心分離ステップによって細胞を収集し、得られたペレットを 50 μl の MgCl2 に溶解しました。 得られた細胞懸濁液 5 μl を、20 アミノ酸すべてを含み、ビタミンサプリメントが異なる 5 つの培地 195 μl に接種しました。 培地の 1 つは対照培地で、前培養培地として 4 つのビタミンすべてが含まれていました。 他の 4 つの培地には、チアミン、ビオチン、ナイアシン、パントテン酸のいずれかのビタミンが含まれていませんでした。 次いで、増殖をTecanプレートリーダーでモニターした(詳細については「増殖アッセイ」を参照)。 2倍化ごとに、プレートリーダーの直線範囲内で指数関数的な増殖を維持するために、培養物を適切に希釈しました。

Rhizobium Leaf68を、20アミノ酸およびビオチン、ナイアシン、およびパントテン酸を含む培地中で20mlの培養物中で培養した。 指数関数後期 (OD~1) では、細胞を遠心分離 (10,000 rpm、2 分間) によって収集し、続いて 2 ラウンドの洗浄と、20 ml の滅菌 MgCl2 および 10,000 rpm で 2 分間のペレット化を行いました。 その後、遠心分離により細胞を回収し、1 mlのMgCl2に溶解した。 培養物を 4 つの振盪フラスコ培養物に 100 μl のこの接種材料で接種しました。培養物の 1 つには 3 つのビタミンすべてと、各ビタミンのドロップアウト培地をそれぞれ補充しました。 OD は倍加ごとに 1 回モニターされ、細胞内メタボロームは次のようにサンプリングされました。 培養物を振盪水浴中で28℃に保ち、OD (1/OD ml)に基づいてサンプル量を決定しました。 決定された量の細胞懸濁液を吸引フラスコの上に置いたフィルター上にピペットで移し、培地を除去した。 フィルター上に置いた細胞を、水浴中で28℃に保った10mlのdH2Oで洗浄し、続いて洗浄したフィルターを、8mlの冷酸性（-20℃）クエンチング溶液（3部）を含むショットフラスコに移した。 MeCN:1部 MeOH:1部の0.05Mギ酸)。 10分後、クエンチング溶液を50 ml Falconチューブに移し、-50℃で一晩凍結乾燥した。 得られた粉末を250μlの予冷したdH2Oに溶解し、分析まで-80℃に保存しました。

LC 分離は、Thermo Ultimate 3000 UHPLC システム (Thermo Scientific) を使用し、流速 500 µl min-1 で実行されました。 2 つの異なる分離方法が適用されました。 最初の分離は、[54] に記載されているように、親水性相互作用 (HILIC; Aquity UHPLC BEH Amide カラム [100 × 2.1 mm、粒径 1.7 μm; Waters]) によって達成されました。 HILIC 分析では、50 μl の水性サンプルを乾燥させ (SpeedVac)、MeCN に溶解しました。 C18 逆相 (C18RP) 分離は、他の場所で説明されているように、Kinetex XB-C18 カラム (粒子サイズ 1.7 μm、細孔サイズ 100 Å; 寸法 50 × 2.1 mm2、Phenomenex) を使用して達成されました [55]。 質量分析では、LC 機器を Thermo QExactive plus 機器 (Thermo Fisher Scientific) に接続し、質量分析計を質量分解能 30,000 (m/z = 400) でポジティブおよびネガティブ FTMS モードの両方で操作しました。 加熱エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) プローブを使用して、次のソース パラメーターを適用しました。気化器 350 °C。 補助ガス５； イオンスプレー電圧 +3.5 kV、シースガス、50; スイープガス、0; 無線周波数レベル、50.0。 キャピラリー温度、275 °C。 データを分析するために、emzed2 [56] を使用してイオンクロマトグラムのターゲットを絞った抽出が実行されました。 保持時間ウィンドウは化学標準に基づいて決定され、選択されたウィンドウはバックグラウンドシグナルに対して正規化されました。

事前実験として、希釈プレーティング法を使用して、OD 単位あたりの CFU 数を決定しました。 コロニーは、5μlのドットからの決定を可能にする希釈液からカウントされました（補足表5）。 次いで、全２０株を固体Ｒ２Ａプレートから２０アミノ酸および１０ビタミンを含有する液体培地に接種し、１０ｍｌの培養体積で生物学的３連で一晩増殖させた。 前培養後、すべての株は定常期にありました。 各培養物のODを測定し、1mlあたり5e8細胞に調整した。 次に、これらの調整された培養物を混合して、各菌株の存在量が約 1/20 となる接種材料を作成しました。 「枯渇実験のLC/MS分析のためのサンプル調製」のセクションに記載されているように、接種材料を洗浄した。 各接種材料から 5 つの配列決定サンプルを採取し、ビタミンを添加した培地とビタミンを含まない培地の両方で 3 つの技術的複製を各接種材料から接種しました。 培養液の量は 20 ml で、培養液は 28 °C で 200 rpm の軌道振とうしながら増殖させました。 9、24、48、72、96、および120時間の時点で、16S rRNA遺伝子配列決定およびエキソメタボロミクス用のサンプルを次のように採取しました。 16S rRNA 遺伝子配列決定の場合、1 ml のサンプルを FastDNA SPIN Kit for Soil の DNA 抽出チューブに移しました。 チューブを遠心分離し（10,000 rpm、5 分間、4 °C）、上清を除去し、細胞ペレットの入ったチューブを凍結し、抽出するまで -80 °C で保管しました。 エキソメタボロミクスの場合、1 ml の培養物を 2 ml エッペンドルフ チューブに移し、遠心分離しました (10,000 rpm、5 分、4 °C)。 200 μl の上清を 96 ウェル プレート上の 2 つの技術的複製に保存し、分析まで -20 °C で保存しました (詳細については「LC/MS 分析」を参照)。

DNAは、FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)を製造業者の指示に従って使用して抽出した。 サンプルを DNA 低結合 96 ウェルプレート (Frame Star 96、セミスカート付き) に移し、二本鎖 DNA QuantiFluor (Promega) を使用して DNA 濃度を定量し、1 ng μl-1 に正規化しました。 16S rRNA 遺伝子アンプリコン ライブラリーは次のように生成されました。 PCR増幅、クリーンアップ、およびバーコーディングPCRは[57]と同様に実行されました。 DNA濃度を上記のように決定し、各ウェルを1 ng μl-1に正規化しました。 次に、各ウェルからの等量をプールした 16S rRNA 遺伝子アンプリコン ライブラリーにまとめ、ビーズ対 DNA 比 0.9 を使用して AMPure 磁気ビーズでライブラリーを 2 回洗浄して小さな DNA 断片を除去しました。 ライブラリのアンプリコン長分布は、HS D1000 (Agilent) を使用して 2200 TapeStation で評価され、有効なライブラリ サイズは 554 ～ 643 bp となりました。 配列決定は、MiSeq 試薬キット v.3 (ペアエンド、2 × 300 bp、600 cyc PE) を使用して、チューリッヒ遺伝的多様性センターの MiSeq デスクトップ シーケンサー (Illumina) で 12 pM サンプルに対して実行されました。 変性、希釈、および DNA ライブラリーへの 15% PhiX の添加は、製造元の指示に従って実行されました。 以前に記載されているように、カスタム シーケンシング プライマーを使用しました [30]。

各株のゲノムは、ソース データ 5 のアクセッション番号を使用して RefSeq をクエリして取得しました。遺伝子は、エッグノッグ マッパーを使用して COG 用語にマッピングされ、すべての株は、次の化合物ごとに反復的に栄養要求性または原栄養性のいずれかとしてラベル付けされました: ビオチン、チアミン、パントテン酸、ナイアシン。 分析は、パスウェイ マッピングが提供されている COG 用語に限定されました (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/pathways/)。 次に、栄養要求株と原栄養株のそれぞれにおける各 COG 項の存在に基づいて分割表を構築しました。 分割表に対して χ2 検定が実行され、p 値と各 COG 用語の存在感がより高いグループに関する情報が保存されました。 結果として得られた p 値は、その後、Benjamini-Hochberg 法を使用して補正されました。 大きく異なる (q 値 < 0.05) COG 用語については、機能的アノテーションが COG データベース API (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/api/cog/) から取得され、生物学的用語にマッピングされました。 KEGG 経由でプロセスを実行します (Biopython から入手可能)。 複数の検定補正の有効性は、栄養要求性/原栄養性ラベルをシャッフルすることによってランダム モデルを生成することによって確認されました。 ランダムに割り当てられた栄養要求性と原栄養性の間で、COG タームの豊富さが大きく異なることはありませんでした。

COG アノテーションから栄養要求性を予測するモデルを作成するために、上記の特徴選択プロセス、または各経路からランダムに選択された COG 項 (500 個のランダム化) に基づいて決定木分類器をトレーニングしました。 まず、サンプリングバイアスを減らすために、補足図1に示されているドロップアウトスクリーニングからの追加の28株を含む35の検証された株のデータセットを追加しました。 この合計 63 のセットは、「train_test_split」を使用したテスト用データの 40% を使用して、バランスの取れたトレーニング データセットとテスト データセットに分割され、sklearn ライブラリの「DecisionTreeClassifier」を使用して最大深さ 3 ノードのデシジョン ツリー分類子が生成されました。

消費者資源モデルを適用して、共培養実験における栄養要求体の成功を分析しました。 消費者資源モデルは、特定の資源を消費する能力の関数として生物の豊かさを表現したものです。 ここでは、消費者資源モデルを適用して、実験的に観察されたCFU数（補足表5）、増殖速度（μ）、および収量を使用して各細菌株の存在量を決定しました。 各株の保持能力 C は、実験的に決定された最大収量に OD あたりの CFU カウントを乗算することによって決定されました (補足表 5 の CFU/OD 列)。 すべてのパラメーターは補足表 6 で明確にされています。

t = 0 では、各菌株の存在量 (CFU/ml) は、実験の開始時に実験的に観察された存在量 (補足表 7 の CFU/ml 列) を 4 で割った値に設定されました (菌株が最初に混合されたため、各菌株の存在量を 20 倍に希釈し、接種材料を 1/200 で新鮮な培地に接種し、最後に 1000 倍して CFU/ml を推定しました。

次に、各時点で各菌株の濃度を更新しました。 ここでは、まず株の増殖速度が Monod 反応速度論に従って更新されました。

ここで、基質親和性 Ks は株の収量 (OD に関して) に比例すると仮定され、すべての株の最大収量を各株の収量で割ることによって計算されました。 各株について、その株の濃度の変化を記述する常微分方程式が定式化されました。

ここで、Cstrain はその株の保持能力または収量です。 これらの菌株固有の方程式は、[グルコース] が最初に 20 mM に設定された場合のグルコース濃度の変化を記述する ODE に結合されました。

合計の下の最初の部分は、成長パラメーター (成長率に 10 を掛けたもの) から各株のグルコース消費率を推定します。 次に、総グルコース消費量は、消費率と収容力に合わせて調整された細胞数から推定されます。 合計の単位は h−1 です。 次に、モデルは scipy の odeint ソルバーを使用して解決されました。

t∈{24,48,72,96} での希釈ステップ (1/200) は次のようにシミュレートされました。

保持容量 C は、上記のように各菌株について個別に決定されました。 図5に示したデータに基づいて、原栄養株の存在下ではビタミン濃度が最大10倍増加すると推定しました。 1 μMのビタミンが培養物に補充されたため、10 μMのビタミンで実験的に決定された収量に基づいて、各株の保持能力CStrainを使用して上記のシミュレーションを繰り返しました（補足図9）。 データが欠落している株については、代わりに運搬能力の平均増加が使用されました。

2 番目の炭素源は、増殖速度が所定の閾値 (0.3 h-1 から 0.6 h-1 まで変化) よりも大きい菌株に対してのみ分泌フラックスを設定することによってシミュレートされました。 分泌フラックスはグルコース取り込み速度から 50% スケールダウンされました。 t = 0 では、S2 = 0。

したがって、急速に成長する株による培地への S2 の分泌は、

このときの[S2]の濃度変化は

S2の濃度と生成速度の式により、生物学的に現実的な濃度範囲が得られました（〜5 mM、補足図10）。 受信側では、S2 の成長率は次のように推定されました。

栄養要求株と原栄養株の効率が同等であるシミュレーションの場合、Scaling_factor パラメーターは 1/3 に設定されました。 栄養要求性をより効率的にするために、栄養要求性のスケーリング係数を 1 に設定し、原栄養性の場合は 1/3 に維持しました。 このパラメータの感度は 1/2 ～ 2 の範囲に設定してテストされました。各菌株の濃度は次のようにシミュレートされました。

\(C_{S_{2,\,Strain}}\) は 70 に設定されました。このパラメーターは、代謝副産物による成長がグルコースによる成長に匹敵する可能性があるという発見に基づいて設定されました [49]。

シミュレーションは時間 t∈{1,2,3,…,120} にわたって繰り返されました。 t∈{24,48,72,96} で、希釈は上記のようにシミュレートされました。

特に明記されていない限り、すべての分析は、カスタム スクリプトを使用して Anaconda3 経由で Python 3.8 を実行している Windows マシン上で実行されました。 データは pandas データフレーム (V 1.1.3) で処理され、数値計算には numpy ライブラリ (V 1.20.1) が使用され、線形回帰と多重テストの修正は sklearn および statsmodels (V 0.23.0 および V 0.12.1) を介して実行されました。 0、それぞれ）の実装。 統計テストには、scipy (V 1.5.2) 実装が使用されました。 API はリクエスト (V 2.22.0) 経由でクエリされ、KEGG は Biopython (V 1.76) 経由でクエリされました。 代謝モデルは、公開されているチュートリアル (https://carveme.readthedocs.io/en/latest/usage.html) に従って CarveMe [33] (V 1.2.2) を使用して生成されました。 連続データの場合、各グループ内の分散に応じて t 検定またはウェルチの t 検定を実行しました。 カテゴリデータについては、χ2 検定を実施しました。 反復回数 (n) と実施されたテストの種類は、それぞれの図のキャプションに記載されています。

コンシューマ リソース モデルの生成に使用される関連コードは、補足資料として入手できます。 上清および枯渇実験の生の LC/MS メタボロミクス データは、MetaboLights https://www.ebi.ac.uk/metabolights/index (アクセッション ID MTBLS5309) で入手できます。 生の配列データは、European Nucleotide Archive https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home?show=reads (アクセッション ID PRJEB55397) で入手できます。

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栄養要求性のスクリーニングと原稿の批判的な読み取りの支援についてはM. Schäfer、COG注釈と系統解析の評価の提供についてはC. Vogel、共培養実験の実験計画の支援についてはS. Pfeilmeierに感謝します。 16S rRNA 遺伝子ライブラリー調製の支援については D. Demaj および P. Kirner、ビタミン滴定実験の実験支援については T. Stewart および J. Kurmann。 有益な議論をしてくださった L. Hemmerle、P. Kiefer、P. Keller と、原稿を批判的に読んでくださった A. Pacheco に感謝します。 チューリッヒ遺伝的多様性センター、特に配列データに関する技術支援と専門知識については S. Kobel 氏、配列データの逆多重化については C. Field 氏に感謝します。 この研究は、スイス国立科学財団 (助成金番号 310030B_201265) の支援を受けました。

スイス連邦工科大学チューリッヒ校が提供するオープンアクセス資金。

微生物研究所、チューリッヒ工科大学、8093、チューリッヒ、スイス

ビルギッタ・ライバック、ミリアム・ボルトフェルド・ミラー、ジュリア・A・ヴォーホルト

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BR と JAV が研究を設計しました。 BR は実験、分析、モデリングを実施しました。 BR と MB-M は、共培養実験、サンプリング、16S rRNA 遺伝子アンプリコン ライブラリーの調製と配列決定を実施しました。 BRとJAVが原稿を書きました。

ジュリア・A・ヴォーホルトへの通信。

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転載と許可

Ryback, B.、Bortfeld-Miller, M. & Vorholt, JA 葉関連細菌によるビタミン要求性への代謝適応。 ISME J 16、2712–2724 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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受信日: 2021 年 10 月 12 日

改訂日: 2022 年 7 月 13 日

受理日: 2022 年 7 月 25 日

公開日: 2022 年 8 月 20 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01303-x

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自然生態学と進化 (2022)